A frustração que fez Rita Fior investigar cancro /premium

07 Julho 20181.063

A investigadora da Fundação Champalimaud não consegue aceitar que os doentes sejam cobaias dos seus próprios tratamentos e quer arranjar maneira de prever como é que o tumor vai reagir aos fármacos.

Ninguém está preparado para um diagnóstico de cancro e muito menos para ver os acontecimentos sucederem-se rapidamente. Mas uma das coisas que deixou Rita Fior perplexa foi o facto de a escolha de um tratamento ser feita (quase) ao acaso. As opções seguem as recomendações para o tipo de cancro em causa e são baseadas na melhor evidência científica existente — mas dois medicamentos tidos como equivalentes podem ter efeitos completamente diferentes num doente. A diferença pode ser tão grande como a vida e a morte. A investigadora está determinada a mudar esta situação.

Tudo começou em 2009, quando a mãe de Rita Fior foi diagnosticada com cancro do pulmão. Ainda nem tinha percebido bem o que estava a acontecer e já a mãe a avisava que tinha uma cirurgia marcada. “Espera lá, então tenho de ir à consulta contigo”, recorda. A investigadora não estava a perceber porque é que um cancro tão pequeno, como diziam ser, estava a deixar a mãe tão inchada e tão cansada. Uns exames adicionais feitos na altura mostraram outras complicações, mas a cirurgia avançou de qualquer forma.

A investigadora, habituada a questionar tudo na vida profissional, foi incapaz de o fazer na vida pessoal e confiou no trabalho dos médicos. Lamenta que assim tenha sido, porque a mãe foi para cirurgia sem ter sido vista por um oncologista, sem ter feito uma única biópsia e, durante a operação, perceberam que não era uma coisa assim tão pequena. “Vim a saber, um ano depois, que não tinham feito o TAC certo”, conta. “Descubro que todos os exames estavam errados desde o início, eles nem conseguem perceber como é que era o tumor inicial.”

“Foi aí que comecei a perceber que havia tratamentos equivalentes, mas com respostas diferentes.”

Passada a fase da cirurgia, a mãe de Rita Fior deveria ser sujeita a três ciclos de quimioterapia e um de radioterapia. Em conversa com uma colega investigadora, Rita Fior percebeu que o medicamento que o médico tinha escolhido, com base nas linhas orientadoras para o tratamento da doença, não era o mesmo que se usava no Instituto Português de Oncologia (IPO). “Passei-me, não é? Não dão isto no IPO, mas o que é que se passa?”, recorda. “Foi aí que comecei a perceber que havia tratamentos equivalentes, mas com respostas diferentes.”

A mãe de Rita Fior respondeu bem ao tratamento, mas podia não ter sido assim. Como não foi quando o cancro reapareceu. “Não sabia que havia opções muito semelhantes. Achava que era um tratamento e pronto”, diz. “Mas, afinal, existem opções, cientificamente aprovadas, feitas em ensaios clínicos com muitos doentes. O medicamento A e o B são equivalentes em termos desses ensaios clínicos, mas só em percentagens.” Da primeira vez, o medicamento escolhido correu bem. Da segunda, usaram outro medicamento e já não teve o mesmo sucesso.

“Mudaram porque mudaram, porque se assume que há resistência. Mas pode não haver”, conta chateada. “Experimenta-se na pessoa. E aquilo começou a dar-me nos nervos.” Irritada com a situação começou a pensar na experiência laboratorial que tinha: “Caramba, será que não se consegue pôr as células tumorais e a droga [numa experiência] e ver se aquilo mata as células ou não?”. A ideia ficou-lhe na cabeça, mas tinha um pós-doutoramento para terminar.

Peixe-zebra: da formação dos neurónios aos cancros

Rita Fior estudava biologia do desenvolvimento até que a frustração — na vida pessoal, não profissional — a levou da embriologia (estudo do desenvolvimento embrionário) ao cancro. Mas uma coisa manteve sempre consigo: os peixes-zebra. E é com estes que agora espera trazer novidades na área que investiga: como escolher o melhor tratamento para um doente com cancro e saber como é que este doente vai reagir ao tratamento.

“A minha motivação foi mesmo irritação, foi frustração, e não curiosidade científica, isso foi o que eu andei a fazer antes [no doutoramento e pós-doc].”

Durante o doutoramento estudou o desenvolvimento dos neurónios no laboratório de Domingos Henrique, no Instituto de Medicina Molecular (IMM) da Universidade de Lisboa. Quis continuar o caminho iniciado na embriologia, mas queria trabalhar com um investigador que “admirava imenso”, o britânico Julian Lewis (1946-2014), do Cancer Research UK. E conseguiu. Foi seu orientador de pós-doc em colaboração com Leonor Saúde, na altura investigadora no Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC), enquanto Rita Fior estudava como se formava a coluna vertebral em peixe-zebra.

Em 2010, um ano depois de iniciar o pós-doc, Rita Fior frequentou um curso de verão nos Estados Unidos com os maiores especialistas em peixe-zebra. Era um curso muito prático em que, entre outras coisas, testavam fármacos nos peixes. Depois do que tinha vivido com a mãe no ano anterior, começou a pensar se não seria possível usar os peixes-zebra para melhorar as opções de tratamento feitas pelos médicos. A ideia parecia-lhe interessante, mas ninguém à sua volta parecia achar o mesmo. De qualquer forma, tinha de se concentrar em acabar o pós-doc.

Só depois disso, quando começou a falar com médicos e cirurgiões começou a encontrar mais recetividade às suas ideias. “Eles têm este problema no dia a dia, escolher entre A e B, dois tratamentos equivalentes”, conta, comparando com o atirar de uma moeda ao ar para ver qual das faces calha. “Com a tecnologia que temos hoje em dia acho que é ridículo.”

Queria seguir esta linha de investigação, mas precisava de financiamento. Mas se 2009 tinha sido um ano difícil, 2012 não foi um ano mais fácil. O estado de saúde da mãe piorou bastante, o pai deu uma queda que se complicou muito e Rita Fior, para dar apoio à família, não conseguia dedicar tempo a procurar fundos para montar o seu próprio laboratório e grupo de investigação. Teve a sorte de se cruzar com Miguel Godinho-Ferreira, investigador no IGC, que tinha uma bolsa do Instituto Médico Howard Hughes e vontade de seguir esta linha de investigação.

Em 2013, no ano seguinte à perda dos pais, Rita Fior começou a trabalhar com Miguel Godinho-Ferreira. Não era a primeira vez que se usavam peixes-zebra para estudar cancro, nem tão pouco era a primeira vez que se usava aquela espécie para testar fármacos, mas para conseguir resultados em que pudesse confiar, os investigadores passaram vários anos a “partir pedra”.

Não foram os primeiros a fazer, mas os primeiros a fazer bem

“Já se fazia investigação em cancro com peixe-zebra e já havia pessoas que tinham tentado fazer exatamente isto: pôr células tumorais no peixe. E tinham publicado”, conta Rita Fior. O primeiro passo era reproduzir a experiência da outra equipa para chegar aos mesmos resultados, mas a investigadora não estava a conseguir. Então, recrutou todas as ferramentas que trazia da sua experiência em embriologia e começou a usar mais marcadores (sinais que permitem identificar células ou moléculas), a identificar cada célula e cada processo para perceber o que estava a acontecer. Refinou o processo ao máximo e percebeu porque é que não conseguia reproduzir os resultados dos colegas — e porque é que os melhores investigadores na área também não confiavam nesses resultados.

“A comunidade científica não acreditava no modelo, porque o que estava publicado tinha problemas técnicos graves. Mas nós resolvemos esses problemas”, conta a investigadora, orgulhosa. Ainda assim, mesmo com melhores resultados, a resposta que conseguia das revistas científicas é que este trabalho já tinha sido feito, já não era novo. Resultado: depois de tanto trabalho, não conseguia publicar o seu artigo científico.

“Resumindo: não fomos os primeiros a fazer este trabalho, mas fomos os primeiros a fazê-lo como deve de ser.”

Foi nessa altura que conheceu Douglas Hanahan, um reconhecido investigador na área do cancro. “É autor do artigo ‘Hallmarks of Cancer: The Next Generation’, não há nenhum artigo em cancro que não o cite.” Douglas Hanahan aceitou ser editor do artigo científico que a investigadora portuguesa queria publicar. E Rita Fior aproveitou a oportunidade para pedir que o artigo fosse revisto e analisado pelos investigadores que se mostravam mais céticos em relação a este modelo animal para estudar o cancro. “Lutei muito por aquele artigo. E também passei pela fase de não acreditar nos resultados no início.”

Mas o processo ainda estava longe de terminar. O trabalho científico tinha sido feito injetando, nos peixes-zebra, células de linhas celulares — células tumorais que foram recolhidas de um doente há muito, muito tempo e que são replicadas em laboratório para poderem ser usadas por equipas de investigação diferentes. Mas os revisores queriam mais, queriam um trabalho com amostras de doentes e com os fármacos. “Fizemos aquilo tudo a correr e conseguimos uns resultados preliminares promissores”, conta Rita Fior. “Foram meses sem parar a tentar ter resultados.” E valeu a pena. Em agosto de 2017 o artigo era finalmente publicado na revista científica Proceedings of the National Academy of Sciences.

Qual o segredo para o sucesso, quando comparado com os colegas que já tinham publicado? Primeiro, é preciso garantir que as células tumorais estão em perfeitas condições, que foram sujeitas a um mínimo de stress. A massa tumoral era dissociada só o suficiente para poder ser injetada nos peixes, sem cultura celular e sem seleção, para as células estarem o mais parecidas com o original possível.

Peixe-zebra com uma massa de células tumorais humanas (a vermelho) e os vasos sanguíneos (a verde) — Rita Fior/Fundação Champalimaud

Depois, o local onde se injetam as células na larva de peixe-zebra. “Não pode ser dentro do vitelo senão as células são comidas pelos macrófagos do peixe.” A outra equipa introduzia as células coradas no vitelo, estas eram comidas pelos macrófagos e transportadas para outras partes do corpo do peixe e os investigadores achavam que eram metástases. Mas Rita Fior confirmou que não. E, por fim, é preciso usar marcadores humanos para ter a certeza sobre quais das células que se estão a observar são células do tumor.

“Penso que o problema daquele grupo foi não ter ninguém formado em embriologia para fazer aquilo, alguém que fosse procurar os marcadores, ter a certeza se o macrófago come ou não, etc.”, diz Rita Fior. Por isso, quando formou a sua equipa, ou os treinou nas técnicas de embriologia ou selecionou diretamente pessoas dessa área. Primeiro no laboratório de Miguel Godinho-Ferreira, no IGC, agora com um espaço dedicado na Fundação Champalimaud.

Que história podem contar os peixes-zebra?

“Apesar dos avanços nos tratamentos dirigidos para o cancro, ainda nos faltam métodos para prever como um cancro específico vai responder a uma dada terapia”, escrevem os autores no artigo. “Como consequência, os doentes passam por ciclos de tentativa-erro baseados nas recomendações até encontrarem o melhor tratamento, muitas vezes sujeitando os doentes a toxicidade desnecessária.”

A utilização de enxertos de cancro em larvas de peixe-zebra para testar os fármacos recomendados pretende dar uma resposta rápida sobre o fármaco que melhor pode funcionar em cada doente. Conseguir resultados rapidamente é uma das grandes vantagens em relação aos modelos de rato usados com o mesmo fim. Enquanto os ratos, o melhor método disponível atualmente, podem demorar dois a seis meses para dar uma resposta e portanto só são usados para uma segunda linha de tratamentos — caso a primeira falhe —, os peixes-zebra, com resultados em duas ou três semanas, têm o potencial de vir a ser usados na seleção dos tratamentos de primeira linha.

Outras vantagens dizem respeito a números: número de animais e número de células. É possível usar muitos mais peixes do que ratos nos ensaios. E a quantidade de células tumorais necessárias para enxertar uma larva de peixe-zebra é muito menor que a quantidade para injetar nos ratos — a diferença entre mil células ou milhões delas. Além disso, como a larva de peixe-zebra é transparente, Rita Fior consegue ver os peixes vivos ao macroscópio. “Consigo ver as células as metastizarem, a entrarem nos vasos sanguíneos, a saírem dos vasos, os vasos sanguíneos a virem para o tumor, os macrófagos a comerem as células tumorais, depois vem os neutrófilos e o que fazem.”

Há ainda um terceiro modelo que Rita Fior identifica como potencial concorrente dos peixes-zebra: os organóides (células organizadas de forma tridimensional para mimetizarem um órgão). “Pelo que está publicado, parece que é um sistema muito bom, mas nunca experimentei. A desvantagem é que é caro e não está num sistema vivo.” O que a investigadora espera ver no modelo de cancro nos peixes-zebra é o potencial de formar metástases e o potencial de recrutar os vasos sanguíneos do peixe para alimentar o tumor (potencial angiogénico). “Se calhar os organóides também vão conseguir fazê-lo”, diz. “O que eu quero é que haja um teste. Se é nos peixes ou nos organóides, não interessa.”

Para otimizar o procedimento laboratorial, os investigadores usaram células tumorais de linhas celulares (com um número virtualmente inesgotável) ou de tumores removidos por cirurgia (que também significam uma grande quantidade de células). Agora, é preciso afinar a metodologia para conseguirem usar massas tumorais muito mais pequenas, com aquelas que são recolhidas nas biópsias, e mesmo assim conseguir bons resultados. “Nos últimos cinco anos, o trabalho tem sido sobretudo otimizar”, diz. “É preciso otimizar para cada tipo de cancro, para cada droga, conhecer o comportamento de cada droga, etc.”

“Já passámos por uma fase em que tínhamos amostras de cirurgia e não dava para quase nada. Agora, às vezes, é imenso”, conta a investigadora. “No início do protocolo conseguíamos zero células das biópsias. Agora, já temos células e já conseguimos injetar. Mas ainda estamos numa fase de otimização.” Ou não tivesse Rita Fior vindo da embriologia e quisesse tudo perfeito. Mais do que perfeito.

“Não consigo fazer de outra maneira. Não quero ter pessoas a não conseguir reproduzir o meu trabalho. Por isso é que demorou muito tempo, tenho de ter a certeza de tudo, tudo, tudo.”

Ainda assim felicita-se com os resultados alcançados e publicados. São apenas uma prova de conceito, uma demonstração do potencial da técnica, mas são promissores. Cinco doentes foram sujeitos a cirurgia para remover o cancro do cólon e depois sujeitos a quimioterapia adjuvante para reduzir a hipótese de recidiva (reaparecimento da doença). As larvas de peixe-zebra receberam os tumores destes doentes e foram sujeitas à mesma quimioterapia para perceber se as células respondiam ou não ao tratamento. Com estes resultados na mão era preciso comparar com o que tinha acontecido com os doentes. “Em quatro dos cinco doentes foi possível correlacionar com o que foi observado nos peixes-zebra”, conta Rita Fior.

Nos casos estudados, quando havia resposta ao tratamento no tumor do peixe, também havia resposta no doente e não se detetavam sinais do tumor. No caso em que as células injetadas no peixe não responderam ao tratamento e continuaram a proliferar, os doentes também já estavam em recidiva. Houve apenas um caso em que o tumor do peixe não respondeu, mas o doente não apresentava sinais de a doença ter regressado. Os investigadores não sabem explicar porquê. “Há ainda um longo percurso a fazer”, admite a investigadora que agora quer testar a metodologia com cancro da mama, reto e pâncreas.

Rita Fior espera publicar os resultados com cancro da mama no próximo ano. O trabalho segue a mesma linha do anterior: uma prova de conceito, com tumores reais de cirurgia (porque ainda estavam a otimizar a metodologia), para perceber como formam as metástases, como reagem às drogas usadas. “Estudar aquilo ao máximo.” Neste trabalho, os resultados mostram que “até os medicamentos da mesma família, que são dados indiferentemente às pessoas, têm resposta numas células, mas noutras não”. Mas, como são da mesma família de fármacos, são dados como se fossem a mesma coisa. A investigadora espera que estes modelos possam dizer aos médicos, “dentro das opções terapêuticas que eles já acham que são as melhores, qual a melhor delas”.

Na massa de células tumorais humanas (a vermelho) vêm-se os macrófagos do peixe-zebra (a amarelo) a comer — fagocitar — as células tumorais. As células tumorais têm a capacidade de recrutar os vasos sanguíneos do peixe (a verde) para lhes fornecerem nutrientes — Vídeo cedido por Rita Fior/Fundação Champalimaud

Que segredos esconde o sistema imunitário dos peixes-zebra?

Na investigação científica, a procura de resposta para determinadas questões pode levantar novas questões e ramificar a investigação para áreas ligeiramente distintas. Foi o que aconteceu com o grupo de Rita Fior: porque é que alguns peixes desenvolviam bem os tumores e outros não?

As larvas de peixe-zebra são escolhidas como modelo porque, nesta fase do desenvolvimento, as larvas ainda só têm sistema imune inato, a primeira linha de defesa, constituída sobretudo por macrófagos e neutrófilos que “comem” (fagocitam) tudo o que identifiquem como elemento estranho. O sistema imunitário adaptativo, que inclui linfócitos e anticorpos, só se desenvolve mais tarde. É esta falta de sistema imunitário adaptativo que permite o transplante de células humanas em peixes.

Claro que o que Rita Fior queria era ter tumores bem desenvolvidos nos peixes para conseguir usar os fármacos e analisar as reações, mas começou a ver que algumas células tumorais, da mesma cultura, desapareciam. “Injetava e passado quatro dias não estavam lá”, conta. “Aí vem a curiosidade: como é que isto acontece?”

“Este é o meu novo projeto: conseguir ter um ensaio para descobrir novas drogas que possam estimular o sistema inato, para depois serem combinados com as novas imunoterapias.”

Em experiências ainda muito preliminares, a investigadora começou a ver que algumas células eram identificadas pelo sistema imune inato e eliminadas pelos macrófagos e neutrófilos, mas que havia outras que se conseguiam escapar. Mais, quando estes dois tipos de células eram misturados, as que conseguiam bloquear o sistema imunitário protegiam as restantes e permitiam que o tumor se desenvolvesse. “Há aqui uma interação humano-peixe que pode ser explorada”, comenta a investigadora. “Este é o meu novo projeto: conseguir ter um ensaio para descobrir novas drogas que possam estimular o sistema inato, para depois serem combinados com as novas imunoterapias”, desvenda Rita Fior, admitindo que é uma ideia arrojada.

Como é que se sabe que são as células do tumor a interferir com os macrófagos e neutrófilos? Quando se injetam tumores em peixes-zebra nos quais se eliminou completamente todo o sistema imunitário, aumentam o número de tumores. Ou seja, mesmo os tumores que tinham sido eliminados nos peixes com sistema imune inato conseguiram desenvolver-se. “O que dá ideia é que algumas células conseguem bloquear, proteger-se ou esconder-se das células do sistema imune.” A investigadora só ainda não sabe como e porque é que isto acontece, mas está a trabalhar para descobrir.

“Às vezes injeto 200 peixes e só tenho 20 tumores. Às vezes, nenhum”, conta a investigadora. Já outros, aqueles que conseguem contornar o sistema imunitário, têm sucesso de implantação de 80, 90 ou 100%. “O que é que é mais fascinante, as células que bloqueiam o sistema imunitário ou a capacidade do sistema imune inato eliminar as células?”, pergunta Rita Fior, com um brilho no olhar de cientista guiado pela curiosidade. As chispas da irritação já só aparecem esporadicamente quando recorda o passado.

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